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MSD在基础免疫学中的应用

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 1.1  MSD与传统基础免疫分析方法学对比

在生命科学研究中，免疫分析是必备手段之一，在蛋白质组学、转化医学等领域有着广泛的用途。随着当今科学的发展，对于免疫分析技术的需求已不止是停留在原来的水平上，而是向着更高灵敏度、更高通量、更宽线性范围、更多元化样本选择、不受基质效应干扰而发展。

MSD与传统的ELISA技术相比的显著优势：更高灵敏度，更宽的线性范围，更节省样本用量，可实现多因子检测。

                                                      

MSD和普通WB相比，显著优势在于: 实验流程更为简便快捷，MSD仅需4.5小时就可以完成整个实验，而传统的WB则需要16小时；MSD结果可相对定量；MSD线性范围5-6 log，而WB通常只有1-2 log；MSD更节约细胞用量。

           

MSD与液相流式技术相比，显著优势在于数据重复性更高，基质效应小，MSD没有液流路系统，从而避免了由液流系统带来的维护保养以及发生故障带来的影响。

 

MSD可以极大的提高实验效率及数据质量，满足实验室对微量样本多指标检测的要求，是目前科研领域实现高精度、高灵敏度、高通量、高数据质量研究的主流设备。

1.2 MSD细胞因子、磷酸化蛋白等检测成品试剂盒

现有配套检测指标检测的物种：人，小鼠，大鼠，非人猿灵长类（猴），犬，牛（小鼠可检测指标有108种；大鼠可检测指标有68种；合计约600种，可检测指标不断加增）

 

适用样本类型：与ELISA或Western Blotting技术适用样本类型相同（良好的抗基质效应，适用于多种样本；具体适用样本参考具体试剂盒说明书）

 

单次测试样本数量：多因子和单因子单次检测均可>80个样本，S600可配套384孔板可同时检测>350个样本

 

MSD成品试剂盒包括五大类： 

 

部分经典成品试剂盒清单：

品名

货号

备注

V-PLEX Human IL-17A Kit

K151RFD

普通ELISA试剂盒灵敏度15 pg/ml，MSD IL-17A单因子试剂盒检测范围0.74–3653 pg/mL

V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit

K15048D

小鼠Th1/Th2经典通路：IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, KC/GRO, TNF-α | Mouse

V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit

K15049D

人Th1/Th2经典通路：IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α | Human

V-PLEX Proinflammatory Panel 2 Rat Kit

K15059D

大鼠Th1/Th2：IFN-γ, IL-4, IL-1β, IL-5, IL-6, KC/GRO, IL-10, IL-13, TNF-α | Rat

V-PLEX Th17 Panel 1 Human Kit

K15085D

人Th17经典通路：IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, MIP-3α | Human

V-PLEX Angiogenesis Panel 1 Human Kit

K15190D

血管新生重要指标组合：FGF (basic), VEGFR-1/Flt-1, PlGF, Tie-2, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D | Human

V-PLEX Chemokine Panel 1 Human Kit

K15047D

MCP-1, MCP-4, Eotaxin, IP-10, MDC, Eotaxin-3, TARC, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 (HA), IL-8 | Human

V-PLEX Human Cytokine 30-Plex Kit

K15054D

Eotaxin, Eotaxin-3, GM-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL-23p40, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, TARC, TNF-α, TNF-β, VEGF-A, IL-8 (HA) | Human

U-PLEX T-Cell Combo Human

K15093K

T helper Th1, Th2, Th9, Th17, Treg, NK 各类T细胞分泌细胞因子经典组合：GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IFN-γ, MIP-3α, TNF-α | Human

U-PLEX TGF-β Combo Human

K15241K

TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 | Human

U-PLEX Biomarker Group 1 Human 71-Plex

K15081K

71因子CTACK, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, EPO, FLT3L, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO-α, I-309, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-29/IFN-λ1, IL-31, IL-33, IP-10, I-TAC, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC, MIF, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-5, SDF-1α, TARC, TNF-α, TNF-β, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A, YKL-40, M-CSF | Human

Phospho (Ser473)/Total Akt Whole Cell Lysate Kit

K15100D

Akt（磷酸化+总蛋白） | Human, Mouse, Rat

Akt Signaling Panel II Whole Cell Lysate Kit

K15177D

GSK-3β, Akt, p70S6K, S6RP | Human, Mouse, Rat（四种磷酸化蛋白）

MA6000 Rat IFN-g 384 Tissue Culture Kit

K213AEB

IFN-g| Rat（384孔高通量检测试剂盒）

MA6000 Mouse IL-1b 384 Tissue Culture Kit

K212AGB

IL-1β| Mouse（384孔高通量检测试剂盒）

MS6000 Human ProInflammatory-4 II 384 Tissue Culture Kit

K21025B

IL-1β, IL-6, IL-8, and TNFα| Human（384孔高通量检测试剂盒）

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1.3 多因子组合检测量身定制试剂盒

1.3.1 V-PLEX多因子自由组合：

1.3.1.1可自由组合的检测指标选择菜单：

选择指标，看横跨的Panel数量，来确定完成所选指标检测需要的板子数量

可选种属

可选指标

Human人

 

（1）Chemokine Panel: Eotaxin, Eotaxin-3, IL-8, IL-8 (HA), IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, TARC

（2）Proinflammatory Panel:IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α

（3）Cytokine Panel 1: GM-CSF, IL-12/IL-23p40, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-1α, IL-5, IL-7, TNF-β, VEGF-A

（4）Cytokine Panel 2: IL-17A/F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-1RA, IL-3, IL-9, TSLP

（5）Th17 Panel 1: IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, MIP-3α

（6）Angiogenesis Panel 1:          FGF (basic), PlGF, Tie-2, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-1/Flt-1

（7）Vascular Injury Panel 2: CRP, ICAM-1, SAA, VCAM-1

 

NHP猴

（1）     Chemokine Panel 1 NHP:Eotaxin-3, IL-8, IL-8 (HA), IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, TARC

（2）     Proinflammatory Panel 1 NHP:IFN-γ, IL-10, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8

（3）     Cytokine Panel 1 NHP: GM-CSF, IL-12/IL-23p40, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-5, IL-7, TNF-β, VEGF-A

Mouse小鼠

（1）Proinflammatory Panel 1: IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, KC/GRO, TNF-α

（2）Cytokine Panel 1:IL-15, IL-17A/F, IL-27p28/IL-30, IL-33, IL-9, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-2

（3）Th17 Panel 1:IL-16, IL-17A, IL-17C, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-31, MIP-3α

1.3.1.2 V-PLEX定制多因子组合的原理详解：

通过点阵技术，在96孔石墨电极板里的每个孔中的不同区域不同spot中预先机器点印上1-10种捕获抗体，从而实现1-10个指标/每孔的检测。 

1.3.1.3 V-PLEX试剂盒流程图(供参考，请根据具体实验做调整)：

           

1.3.2 U-PLEX多因子自由组合：

1.3.2.1可自由组合的检测指标选择菜单：

（选择指标，一般每10个指标在一块板子上检测，注意部分指标之间有交叉反应）

可选种属

可选指标

Human人

CTACK, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, EPO, FLT3L, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO-α, I-309, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-29/IFN-λ1, IL-31, IL-33, IP-10, I-TAC, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC, MIF, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-5, SDF-1α, TARC, TNF-α, TNF-β, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A, YKL-40, M-CSF , BAFF, BDNF, β-NGF, C-Peptide, FGF-21, FGF-23, FSH, Ghrelin (active), Ghrelin (total), GIP (active), GIP (inactive), GIP (total), GLP-1 (active), GLP-1 (inactive), GLP-1 (total), Glucagon, Insulin, Leptin, Luteinizing Hormone (LH), PP, Proinsulin, PYY (total)| Human

NHP猴

CTACK, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, FLT3L, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, I-309, IFN-α2a, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17F, IL-18, IL-22, IL-23, IP-10, I-TAC, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, M-CSF, MDC, MIF, MIP-1α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-5, SDF-1α, TARC, TNF-α, TNF-β, TPO, TRAIL, VEGF-A, YKL-40, IFN-γ, IL-2, MIP-1β, GM-CSF, GRO-α | Non-human primate

Mouse小鼠

EPO, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17C, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27p28/IL-30, IL-31, IL-33, IP-10, KC/GRO, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MIP-3α, TNF-α, VEGF-A | Mouse

1.3.2.2 U-PLEX多因子自由组合开发实验：

MSD多因子开发一套试剂耗材，可以配合多种指标的抗体对进行多因子的开发：

品名

货号

备注

U-PLEX Development Pack, 2-Assay SECTOR Plate

K15227N

包含：(1)U-PLEX Linker Set, n-Assay ;

(2)U-PLEX n-Assay, 96-Well SECTOR Plate;

(3)U-PLEX Stop Solution;

(4)Read Buffer T4X

 

n≤10

U-PLEX Development Pack, 3-Assay SECTOR Plate

K15228N

U-PLEX Development Pack, 4-Assay SECTOR Plate

K15229N

U-PLEX Development Pack, 5-Assay SECTOR Plate

K15230N

U-PLEX Development Pack, 6-Assay SECTOR Plate

K15231N

U-PLEX Development Pack, 7-Assay SECTOR Plate

K15232N

U-PLEX Development Pack, 8-Assay SECTOR Plate

K15233N

U-PLEX Development Pack, 9-Assay SECTOR Plate

K15234N

U-PLEX Development Pack, 10-Assay SECTOR Plate

K15235N

 

 

1.3.2.3 U-PLEX 实现多因子组合检测的奥秘：

U-PLEX plate每个孔内有2-10个spot，每个spot分别与不同linker匹配，linker有生物素结合区域，可以结合生物素化的捕获抗体。因此捕获抗体可以被linker带到相应的spot里。 

1.     U-PLEX Linker 连接

  例如检测三种指标，第一步，将三种指标对应的生物素化捕获抗体与三种linker，分别在三支试管内混合，孵育后加入stop solution终止反应。

2.     混合Linker 链接的不同抗体

第二步，将三种Linker链接的捕获抗体混合，将混合液包被U-PLEX plate，不同的Linker就会带着链接的捕获抗体到相应的spot中。

 

可以混合多达十种Linker 链接的抗体，但不同的抗体需要链接不同的Linker。

 

3.     后续流程同ELISA，完成实验

 

U-PLEX plate的各个spot内包被有相应Linker链接的捕获抗体之后，后续流程同ELISA：加入待测样品孵育，加入Sulfo-Tag标记的二抗进行检测。根据各个spot相应位置的光信号值，定量各检测指标的浓度。

 

                  

 

1.3.2.4  U-PLEX实验流程图(供参考，请根据具体实验做调整)：

 

              

               

1.3.3 R-PLEX-经血清血浆验证抗体对+标准品试剂盒（可开发单因子及多因子检测）

 

R-plex试剂盒内含：Sulfo-tag标记检测抗体+Biotin标记捕获抗体+标准品。

R-PLEX抗体对可在Small Spot链酶亲和素板子上进行单因子检测：

R-PLEX抗体对可在U-PLEX多因子板子上进行多指标组合检测：

 

R-PLEX每款试剂盒对应的指标有推荐的样本/标准品稀释液、抗体对稀释液，需注意查看MSD官网https://www.mesoscale.com

1.4   传统平台升级：ELISA转化，WB转化

实现ELISA转化有两种形式：

                （1）成品高灵敏单因子MSD试剂盒（多款产品，具体货号请咨询）；

                （2）将抗体对转移到MSD技术平台。

 

ELISA转化实验原理图：       

                          

只需两步，轻松实现ELISA转化，获得MSD高灵敏、宽线性范围检测优势：

                       （1）将标记物从HRP换成sulfo-tag三联吡啶钌；

                       （2）将板子从普通塑料板换成石墨烯板子

ELISA转化具体实验流程（供参考，请根据具体实验做调整）：

（1）捕获抗体按照说明书使用PBS稀释到工作浓度(1-20ug/ml)，在L45XA空板中加入40ul, 4℃包被过夜。

（2）150ul/孔加入 Blocker A工作液(1%)，室温震荡 (300-1000rpm, 一般700rpm)孵育1h。

（3）150ul/孔加入PBST (PBS+0.05% Tween 20)或Wash buffer，洗板三次

（4）标准品及样本进行合适倍比稀释，加入50ul样本上样，室温震荡孵育(300-1000rpm, 一般700rpm) 2h。

（5）150ul/孔加入PBST或Wash buffer，洗板三次

（6）生物素化检测抗体按照说明书稀释到工作浓度(0.25-2ug/ml)，25ul加入孔内，室温震荡孵育1-2h。

（7）150ul/孔加入PBST或Wash buffer，洗板三次

（8）Streptavidin Sulfo-TAG标记物按照说明书稀释到合适浓度（0.2-2ug/ml, 一般用0.5ug/ml），25ul加入孔内，室温震荡孵育(300-1000rpm, 一般700rpm) 1h

（8）150ul/孔加入PBST或Wash buffer，洗板三次

（9）150 µL/孔加入2XRead Buffer T，在MSD仪器上读板

所需试剂耗材：

组分

品名

货号

备注

96孔板

MULTI-ARRAY® 96-well Sm Spot Plate Pack

L45XA

空板，微孔（灵敏度更高）；

可以包被无标记捕获抗体

MULTI-ARRAY® 96-well Plate Pack

L15XA

空板；可以包被无标记捕获抗体

MSD GOLD 96-well Streptavidin SECTOR Plate Pack

L15SA

链霉亲和素包被板；

可以包被生物素化捕获抗体

标记试剂

Streptavidin Sulfo-TAG Labeled

R32AD

链霉亲和素连接的sulfo tag

MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester

R91AO

无标记sulfo tag

封闭液

MSD Blocker A Kit

R93AA

封闭液，减少特异性结合；也可稀释抗体对及样本，必要时需要MSD diluent buffer进行稀释

读板液

MSD Read Buffer T

R92TC

读板液

抗体对

各指标对应的优良抗体对

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

案例分享：

Really Data-OVA IgE Detection，ELISA平台转到MSD平台，灵敏度和线性范围均有了改善，检出率从50%提升到100%

 

 

上海优宁维生物科技股份有限公司

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