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免疫染色3-免疫染色前处理

1.固定

样本的固定步骤十分关键,决定着实验的成败。理想的固定剂可以使样本保存的“栩栩如生”,同时,还会通过交联和抑制内源酶快速阻止样本自溶降解过程。针对不同样本的固定有不同的实验方法。

 

(1)组织
经新鲜冰冻并在冰冻切片机内切片的样本可以使用固定剂进行处理。或者组织样本也可以首先经过心脏灌注固定法固定,梯度蔗糖脱水、低温保存几个步骤进行固定保存,然后再进行冰冻切片。


在IHC实验中,除了上述冰冻切片法外,在组织进行灌注固定后,可再进行石蜡包埋和切片。但要注意的是,石蜡切片在进行抗体孵育之前,必须对切片进行脱蜡复水及抗原/表位修复步骤,即使用二甲苯脱蜡,并通过热修复或酶修复对组织切片进行处理。

 

针对于石蜡包埋的样品,需进行脱蜡、复水操作。

为使抗体结合及染色,需将石蜡完全清除。这需要经过一系列的二甲苯/乙醇/水清洗,以清除石蜡,并使组织复水以便于之后的抗体结合。石蜡清除不彻底可导致染色出现斑点及背景染色不均匀。如发生该情况,则需利用新鲜的二甲苯制备新切片以重复实验。脱蜡和复水步骤完成之后,在接下来的操作流程中,应避免载玻片变干,否则会导致染色结果背景变高。

 

(2)细胞
在ICC/IF-IC实验中,应快速固定样本,以便准确保存细胞结构和靶标定位,同时,还利于抗体识别并标记相应靶标。快速将培养截止更换为固定剂,即可实现这一点。


*小优博士Tips:固定方法选择可以有多种选择,而最佳的固定方法取决于样本类型、靶蛋白及抗体。

 

2.固定剂的选择

多聚甲醛、福尔马林(由溶解甲醛和较低比例的甲醇混合而成)和戊二醛等醛基固定剂都是十分常用的固定剂。针对大多数抗体,优宁维建议使用浓度为4%的多聚甲醛。醛与细胞内蛋白发生反应、形成交联,从而稳定固化样本。交联程度及信号保存情况主要取决于固定时间,固定时间不足会导致抗原降解、位移,或出现组织形态破损,影响染色结果;而固定时间过久,会使靶蛋白交联过度,虽然经过后续的抗原修复,也无法保证足够的抗原性,影响染色结果。一般来讲,对于组织切块的固定时间推荐为12-24h,而对于涂片的细胞样本,固定时间为15min左右即可。


*小优博士Tips:需定期更换陈旧的固定液,陈旧溶液可能会加剧自发显色/荧光。

 

3.抗原修复

如果固定时选择醛类固定剂,会使靶蛋白形成交联,阻止抗体与抗原接触,防止抗体结合;因此,在染色之前需要经过抗原修复(也称为抗原暴露或抗原表位修复)过程来逆转交联。抗原修复可通过热诱导的方法(heat-induced epitope retrieval,HIER)或者酶解达到。具体选用哪种抗原修复方式需参考抗体说明书的推荐方法。

 

热诱导的抗原表位修复(HIER)

缓冲液选择 适用于HIER的缓冲液有多种,优宁维主要推荐两种常用的缓冲液,分别是pH 6, 10 mM的柠檬酸盐缓冲液,和pH 8, 1 mM的EDTA缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于选择的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的特异性抗体的修复缓冲液。一般来说,EDTA缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸的特异性抗体,而柠檬酸盐缓冲液适用于其它多数抗体。实验时使用的HIER缓冲液应为新制备的1×溶液。


煮沸装置 载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后,才可引起抗原修复。该步骤优宁维建议在科研用微波炉或高压锅中进行。虽然,一些研究人员也使用水浴锅,但是,因为这一步骤所选的装置对染色存在较大影响。所以,我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸,以达到最佳的抗原修复效果。


*小优博士Tips:此步骤如用微波炉进行,需选用科研用微波炉,普通家用微波炉会由于加热不均匀影响抗原修复效果。

 

酶促抗原修复

 

胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶K进行的酶解作用也可达到抗原修复。一些抗体需要通过酶解而非HIER进行修复。产品说明书中将明确说明所推荐的酶以及酶解条件。

 


*小优博士Tips:需注意的是抗原修复要求抗体对特异抗原而非蛋白本身具有特异性。因此,针对同一蛋白质,使用不同的抗体进行免疫染色时,也要注意抗原修复条件可能是不同的,需要根据说明书选择并确定最佳的修复条件。

 

4.通透化处理

如果使用交联性固定剂,质膜将仍保持完整,抗体无法检测胞内靶标。因此,在IF-IC和IF-F分析中,交联固定后都应进行通透化处理,除非所使用的抗体能识别胞外表位。通透化处理一般选用Triton X-100或其他去垢剂(比如NP-40、TWEEN、皂苷、洋地黄皂苷和DOTMAC等)移除细胞膜中的多种分子,形成各种“孔道”,使得抗体可以进入胞内。或者,也可在固定步骤之后,使用乙醇或甲醇进行醇类通透化处理(如用甲醇或丙酮作为固定剂,则无需通透化处理)。同固定一样,最佳通透方法也根据所选用的抗体来调整确定。需参见抗体说明书中建议的方法。

 

5.封闭

封闭步骤可减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本地信号。理想情况是,封闭剂将占据样本中的“黏性”位点,比如暴露的带电性或疏水性蛋白表面,同时不会干扰一抗/二抗识别靶标为,从而尽可能提高信噪比(S/N)此步骤中所使用的最佳封闭剂也需要根据所使用的抗体进行调整,需要参见产品说明书中的建议。通常,对于IHC-P,我们建议使用含有Tween 20的TBST缓冲液和5%正常山羊血清(NGS)进行封闭;而对于IHC-F,在含有0.3%Triton X-100的1×TBS和5%NGS中进行封闭;针对IF实验,我们最常建议使用的是在PBS中加入5%NGS(或使用与二抗相同物种来源的血清)+0.3% Triton X-100。封闭条件一般为室温湿润条件下(湿盒中)1小时左右。


*小优博士Tips:在检测磷酸化蛋白时,封闭液应尽量选用NGS或与二抗相同物种来源的血清,我们不建议使用含有酪蛋白的封闭液,因为酪蛋白封闭液会导致磷酸化特异抗体的信号减弱。另外需要注意的是,封闭液中需避免加入叠氮化钠,叠氮化钠会影响后续的染色反映,导致信号减弱或出现假阴性。

 

除了需要封闭步骤解决一抗/二抗与样本非靶标位点的非特异性结合,影响免疫染色实验结果的另一重要因素是自发显色/荧光,这是指在没有进行任何免疫染色,或没有添加任何实验性荧光基团时,样本包括组织和细胞在内的材料发射出本底的颜色或荧光的一种现象。这种自发的显色/荧光也会对结果产生较为严重的干扰。例如脂褐质(一种老化组织中积聚的不溶性溶酶体聚合物)。其在显微镜下呈现褐色,与IHC染色中DAB显色方法信号颜色接近,并且在较短波长的荧光通道下(绿色/黄色/橙色)发出较强荧光。优宁维在这里建议您如果担心样本中可能会出现自发显色/荧光,尤其是针对微弱的信号,您可以设置一项对照,以比较使用/未使用抗体/显色基团的信号强度有何差异。

 

6.淬灭

如果是进行IHC实验,且使用的是基于HRP的检测系统,那么在一抗孵育之前,需要淬灭样本中内源性过氧化物酶的活性。方法如下:对于IHC-P,将载玻片置于经蒸馏水稀释的3%过氧化氢(H2O2)溶液中淬灭10分钟;对于IHC-F,则在甲醇中稀释H2O2。


*小优博士Tips:因为H2O2不稳定,易分解,淬灭反应液应现配现用,并且淬灭过程应避光进行。

免疫染色前相关产品列表

产品货号

产品名称

产品规格

用途

abs42237599

4%多聚甲醛/通用型组织固定液

 

样本固定

12606S

16% Formaldehyde

500 ml

样本固定

abs42155597

Paraformaldehyde solution 4% in PBS

 

样本固定

A80400011

抗原修复仪

1台

抗原修复

CTS016

Antigen Retrieval Reagent Sampler

50 ml

抗原修复

abs42027456

Sodium Citrate, Dihydrate

 

抗原修复

abs49001012/14

牛血清白蛋白(BSA)

50/100 g

封闭

abs933

山羊血清

10/50 ml

封闭

abs935

驴血清

10/50 ml

封闭


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